真核细胞的复杂生命活动不仅有赖于多种细胞器之间的精密协同作用，而且是各种生化参数精确调控的结果，因而具有高度的时间和空间动态特性。因此对活细胞生理过程的观测不仅需要多目标高速成像的能力，还要求能够对细胞内特定物化参数进行定量探测。

荧光显微成像技术由于其特异性的标记能力以及与活体细胞的兼容性在细胞生理活动探测中广受青睐。然而分子荧光的光谱带宽较大（>50 nm），因此在可见光范围内多色荧光显微成像的目标一般仅限于3~4个，难以满足对活细胞复杂过程的观测需求。另一方面，荧光生物传感探测分子(biosensor)是实现对细胞内特定生化参数测量的主要工具。其定量测量大多依赖于探测复杂的光谱变化，所以这种定量成像与多色成像的结合对于现有的荧光显微技术是一大挑战。

光谱成像技术提供了解决以上问题的潜在途径。但是一般基于荧光发射光谱的光谱成像技术往往有赖于逐点扫描来积累不同空间位置的光谱信息，因而不能满足高速成像的需求。相比之下，荧光激发光谱可实现对宽场成像（wide-field imaging）的快速扫描，从而大大提高光谱显微成像的速度。不过，相关研究尚不成熟，有较大局限性。

近日，加州大学伯克利分校化学学院的许可教授团队开发出了一种荧光激发光谱显微成像系统，实现了活细胞内多达六种细胞结构的同步动态观测，且不同成像目标间的颜色串扰低于2%；更重要的是，该技术首次实现了多目标成像与定量生物传感测量的结合，揭示了线粒体自噬过程中的多细胞器相互作用以及线粒体pH定量变化模型。

该光学成像系统的结构如图1所示。研究人员使用具有宽带光谱的高功率等离子光源，利用声光可调谐滤波器（AOTF）对激发波长进行高速扫描，实现了与相机帧率同步的不同波长循环激发。

图1. 激发光谱显微成像系统及其对活细胞内六种结构的同时成像表征

这一设计提供了对激发波长的灵活选择性，研究人员从而采用光谱显著重叠的六种荧光小分子或者基因编码表达的荧光蛋白对活细胞内进行标记（包括线粒体、内质网、溶酶体、DNA、脂肪小滴和细胞膜在内的六种目标），实现了同步、长时程动态观测，且不同目标间的颜色串扰仅为1.3%。此外，研究人员还实现了时间分辨率达到约10毫秒的多目标成像，其成像速度仅受限于相机的帧率。

在此基础上，研究人员揭示了一种由内质网介导的脂肪小滴的新融合机制（图2）。

图2. 高速激发光谱成像揭示内质网（黄色）介导的脂肪小滴（紫色）的快速融合过程

除了多目标成像之外，研究人员还将此成像系统扩展至生物传感，进而实现对活细胞内特定参数的高时空分辨率的定量观测。研究人员选择了具有二重态激发光谱的pH值探测荧光蛋白（pHRed）和基于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET）的大分子拥挤程度（macromolecular crowding）探测荧光蛋白对。通过对其局域激发光谱的线性解析，分别得到了线粒体基质的绝对pH值，以及细胞质内的大分子拥挤程度在二维空间的分布图。

通过长时程、高时空分辨率的观测，成功揭示了线粒体基质pH突升和线粒体的形态变化的同步关系，以及活细胞内细胞质和细胞核对外界的高渗透压和低渗透压作用的不同反应模式（图3）。

图3. 基于激发光谱的活细胞pH值（左）和拥挤程度（crowding；右）的定量显微成像

光谱成像的另一个挑战是结合多目标成像与定量生物传感探测。研究人员利用激发光谱成像解析了线粒体自噬（mitophagy）过程中多个关键细胞器和蛋白（包括线粒体、自噬体、溶酶体和Parkin蛋白）的动态特性，同时监测了线粒体基质的pH值在自噬过程中的定量变化。这一成像结果揭示了在Parkin/Pink1介导的线粒体自噬过程中不同细胞器的复杂的动态相互作用，以及线粒体pH值在这一路径中逐渐降低的变化趋势。

图4. 激发光谱成像同时实现活细胞内线粒体自噬过程中的多目标成像和pH探测

总体而言，基于荧光激发光谱的显微成像技术独到地结合了宽场成像的优势，具有优异的时空分辨能力；其通过光谱线性解析定量区分不同成分的能力不仅实现了多目标的高速成像探测，同时也能结合各种生物传感分子实现生化参数的定量成像表征。在后续工作中课题组可望结合光片照明技术（light-sheet illumination）将这种定量多目标成像扩展到三维空间；或者应用结构光照明，实现超分辨定量成像。另一个潜在发展方向是开发其他具有光谱特异性的生物探针，从而结合激发光谱成像以实现对活体细胞内多种结构和功能的定量探测。

文章来源：中国光学